细胞转染技术在基因治疗和细胞治疗开发中扮演着重要角色。为了提高转染效率和病毒包装产量，研究者们需要对转染工艺中的多个参数进行优化。本文将综合探讨细胞转染优化的关键方向，并提供实用的实践指南。

一、引言

核酸递送是生物学研究、转基因和基因治疗的重要环节。由于核酸酶的普遍存在和核酸的高分子量特性，外源核酸很难独立进入靶细胞，且易被溶酶体降解。因此，开发有效的核酸运载体是关键。聚乙烯亚胺（PEI）作为一种核酸运载体，已被应用于细胞转染。然而，转染效率受到多种因素的影响，优化这些条件对于提高实验成功率十分重要。

二、细胞转染优化的关键方向

1、培养基选择

细胞培养基是细胞生长的基础，其成分直接影响细胞的活力和转染效率。无血清培养基在转染过程中具有较大优势，能够支持高密度细胞生长且不影响转染效果。推荐使用以下培养基：

血清的质量和用量也需重视。建议在无血清或低血清（2%-5%）条件下进行转染，以避免血清中的蛋白因子干扰质粒DNA与PEI的结合。

在悬浮细胞培养中，培养体积对产量有较大影响。建议在小体积模型中进行条件摸索，选择合适的培养体积以达到更佳生产效果。对于总容量小于500ml的摇瓶，培养总体积不超过20%；对于总容量大于500ml的摇瓶，培养总体积不超过30%。

细胞质量是影响转染效果的重要因素。选用处于对数生长期、活力高、代次低（30代以内）的细胞进行转染，可获得更佳效果。细胞汇合度和传代次数也会影响转染效率，建议使用低代次细胞以确保基因型不变。

细胞密度直接影响细胞的生长速率和代谢。建议细胞密度维持在1~2×10^6/ml，也可尝试高密度（如5×10^6/ml）以优化转染效果。

高质量的质粒DNA是转染成功的关键。质粒纯度应满足A260/A280值在1.8左右，且内毒素需清除干净。质粒用量需根据细胞数量和转染试剂的要求进行调整，一般为1~2μg / 1×10^6细胞。

在病毒包装过程中，质粒比例对转染效率和病毒产量十分重要。对于AAV包装，初始建议质粒比例为Ad plasmid：Rep+Cap plasmid：transfer target gene = 2:1.5:1。

质粒DNA与PEI的比例直接影响复合体的稳定性和转染效率。建议从PEI与质粒DNA比例为2:1开始优化。

孵育体积影响质粒DNA与PEI复合体的形成和与细胞的有效接触。建议孵育体积维持在总培养体积的5%-10%。

推荐采用AB液的形式，即分别配置质粒DNA溶液和PEI溶液，然后将PEI溶液加入质粒DNA溶液中。孵育时间建议控制在10-20分钟。

病毒颗粒的收获时间影响病毒滴度。建议慢病毒在转染后48小时收获，AAV病毒在转染后72小时收获。

三、结论

细胞转染的成功依赖于对多个参数的严格优化。通过合理选择培养基、控制培养条件、优化细胞状态和转染试剂的使用，可以明显提高转染效率和病毒包装产量。希望本文的指南能为研究者提供实用的参考。

四、参考文献

[1] Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies.

[2] Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector.

[3] Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences.