马脐血间充质干细胞(eUC-MSC)在PBS垂直轮生物反应器中基于微载体的高倍扩增工艺

01   摘 要

间充质干细胞 (MSCs) 作为一种具有免疫调节和分化能力的细胞，在细胞治疗领域展现出较大潜力。马MSCs (eMSCs) 在治疗马匹的关节损伤方面尤其具有优势，例如半月板损伤、软骨退化和骨关节炎。然而，eMSCs的临床应用面临着生物制造方面的挑战，特别是如何实现细胞数量的大规模扩增。传统的静态培养方法无法满足临床应用的需求，而生物反应器技术则提供了一种可行的解决方案。

02   扩增工艺和结果展示

1.  垂直轮生物反应器：eMSCs放大生产的理想系统

PBS生物技术公司开发的垂直轮式 (VW) 生物反应器，是eMSCs的放大生产的理想系统。垂直轮生物反应器独特的混合模式，结合了径向和轴向流体流动，有效地降低了剪切应力，同时实现了效率更高的混合，从而为细胞生长提供了更好的环境。

2.  研究团队通过三个不同规模的放大实验，验证了垂直轮生物反应器在eMSCs放大生产中的优势

图1.eCB-MSCs在垂直轮生物反应器中放大扩增的研究设计示意图

（A）从0.1升到0.5升垂直轮生物反应器的规模放大；

（B）直接从静态培养中在3L垂直轮生物反应器中的扩增；

（C）模拟的规模放大过程，用于细胞治疗，包括两次静态传代，随后进行两次生物反应器传代。

2.1  从0.1L到0.5L的放大

这是放大生产的第一步，将eCB-MSCs从0.1L规模的垂直轮生物反应器转移至0.5L规模的垂直轮生物反应器。结果显示，两种规模的生物反应器在细胞扩增方面取得了相似的效果，证明了垂直轮生物反应器在较小规模上的可扩展性。

图2.eCB-MSCs在0.1L垂直轮生物反应器中的扩增，并传代至0.5L垂直轮生物反应器（生物工艺A）

（A）0.1升和0.5升垂直轮生物反应器中细胞附着密度的变化；

（B）0.1升和0.5升垂直轮生物反应器中的收获细胞密度；

（C）不同培养容器中eCB-MSCs在不同天数的生长图像（绿色荧光为细胞核染色）。

2.2  将静态培养与计算机控制的PBS 3L生物反应器进行比较

为了验证3L生物反应器在放大生产中的优势，研究团队将其与静态培养进行了比较。3L生物反应器通过计算机控制系统维持了更好的pH、溶氧量和温度，最终细胞密度达到1.5 × 105细胞/cm2，收获了1.5 × 109个细胞，证明了其在放大生产中的优势。

图3.eCB-MSCs在3L垂直轮生物反应器中的扩增，与0.1L垂直轮生物反应器和静态培养的对比（生物工艺B）

（A）在不同培养容器中细胞附着密度的变化；

（B）3L垂直轮生物反应器中的CO2控制输入；

（C）3L垂直轮生物反应器中的氧气控制输入及溶解氧（DO）测量；

（D）不同培养容器中在线和离线pH值测量的变化；

（E）第5天eCB-MSCs在微载体上和静态培养中的生长图像（绿色荧光为细胞核染色，蓝色为肌动蛋白染色）。

2.3  模拟临床试验流程，从静态培养放大到3L计算机控制生物反应器

为了更接近真实的临床试验流程，研究团队模拟了从静态培养到3L计算机控制生物反应器的放大过程。结果显示，细胞扩增效率和细胞质量均保持稳定，进一步验证了垂直轮生物反应器在放大生产中的可行性和稳定性。

图4. eCB-MSCs在模拟临床试验生物工艺（生物工艺C）中的扩增

（A）在不同培养容器中细胞附着密度的变化。误差条表示样本间的标准差；

（B）3L垂直轮生物反应器中的控制CO2输入及在线pH值；

（C）3L垂直轮生物反应器中的控制氧气输入及溶解氧（DO）测量；

（D）第5天eCB-MSCs在微载体上和静态培养中的生长图像（绿色荧光为细胞核染色，蓝色为肌动蛋白染色）；

（E）每个下游处理步骤中的收获效率和细胞损失情况。

2.4  扩增的eCB-MSCs功能与表型分析

研究团队对放大生产后的eCB-MSCs进行了功能和表型分析。结果显示，eCB-MSCs在细胞表型、功能和免疫调节能力方面均保持稳定，满足临床应用的要求。

图5.在生物工艺B（A–C）和生物工艺C（D–F）中扩增的eCB-MSCs功能和表型

（A）生物工艺B细胞分析的示意图；

（B）体外软骨分化的组织学评估，使用托鲁蓝染色（i–iii）和苏木精-伊红染色（iv–vi）（i和iv - 3L生物反应器，ii 和 v- 0.1升生物反应器，iii 和vi-静态培养）；

（C）eCB-MSC标志物和外周血单核细胞（PBMC）分析的流式细胞术结果，用于生物工艺B；

（D）生物工艺C分析的细胞的示意图；

（E）体外软骨分化的组织学评估，使用托鲁蓝染色（i–iii）和苏木精-伊红染色（iv–vi）（i和iv - 3L生物反应器，ii 和 v- 0.5升生物反应器，iii 和vi - 静态培养）；

（F）eCB-MSC标志物和PBMC的流式细胞术分析，阳性对照为用ConA处理的淋巴细胞，阴性对照为未用ConA处理的淋巴细胞。

2.5  细胞静态恢复实验

为了评估3L垂直轮生物反应器中收获的eCB-MSCs的增殖潜力，研究团队进行了细胞静态恢复实验。结果显示，3L垂直轮生物反应器中收获的eCB-MSCs具有更高的增殖潜力。

图6.从3L垂直轮生物反应器中收获的eCB-MSC的静态恢复与生物工艺C中的静态培养相当

（A）实验设置的示意图；

（B）接种1天后细胞附着在T形瓶中的分析；

（C）收获的细胞在培养6天后的倍增情况，比较了从3L垂直轮生物反应器和静态T形瓶中收获的细胞；

（D）接种1天和6天后，从3L垂直轮生物反应器或静态T形瓶中传代的细胞图像。

2.6  理论细胞产量

理论细胞产量计算部分：基于Bioprocess C的理论细胞产量计算，通过垂直轮生物反应器进行放大生产，按照起始细胞量接种7.5e5个细胞，经4代放大培养，可收获约760亿个细胞高质量eCB-MSCs，满足临床应用的需求。

图7.使用在模拟临床试验规模扩增生物工艺（生物工艺C）中每次传代获得的收获细胞数，计算的理论细胞产量，以及每次传代所需的相应体积

03   未来展望

未来研究可以进一步优化下游处理步骤，提高细胞收获效率。此外，还需要进行更多的研究，以确认垂直轮生物反应器放大生产的eCB-MSCs在体内也具有相似的免疫调节和分化能力。

04   总结

PBS垂直轮生物反应器为eMSCs的放大生产提供了理想的平台，为eMSCs的临床应用带来了新的希望。这项研究为eMSCs生物制造领域的发展开辟了新的道路，为马匹和其他动物的健康带来了福音。

垂直轮生物反应器的优势

·  可扩展性：垂直轮生物反应器独特的混合模式使其能够在不同规模上保持相似的流体动力学特性，从而实现细胞扩增效率的稳定。

·  控制性：计算机控制系统可以精确控制pH、溶氧量和温度等关键参数，确保细胞在更好的环境中生长。

·  效率高：垂直轮生物反应器的效率更高的混合和细胞附着特性，可以更大程度提高细胞扩增效率和收获率。

·  效率高的低剪切力悬浮体系：基于微载体培养的细胞得到成分悬浮培养，细胞质量良好。放大生产后的eCB-MSCs在细胞表型、功能和免疫调节能力方面均保持稳定，满足临床应用的要求。

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