随着细胞治疗领域的快速发展，稳定、可重复的iPSC扩增成为推动治疗的关键。通过系统化的生物过程设计，识别并优化关键过程输入变量，实现了iPSC在PBS垂直轮反应器内扩增的稳健性与可重复性，减少生产成本和周期，为大规模生产和临床应用提供保障。

一、生物反应器微缩模型—优化iPSC工作流程的效率经济工具

诱导多能干细胞（iPSC）及其衍生特化细胞的生产流程既复杂又漫长，涉及多个相互依赖的工艺输入变量（PIVs）。对于临床应用所需的大批量iPSC衍生细胞（超过10^8个细胞），大规模生物反应器是不可或缺的。然而，运行大规模反应器的成本高昂，因此，在确保细胞产量和质量的同时，首先需要开发出在小规模（100-500 mL）下可重复且稳健的过程。

图1a.一个iPSC制造过程的示例，其中每个单元操作及单元操作之间的过渡都会引入新的工艺输入变量（PIVs）。过程输出变量（POVs），如细胞产量、活力、生长速度、形态、身份特性、功能、基因组稳定性、无菌等，都取决于每个PIV的影响总和。

在生物工艺开发的过程中，PBS Biotech明确了以下关键概念：

1.种子培养阶段（Seed train）：培养足够数量的细胞，以便接种到生产阶段的生物反应器中。

2.可复制性（Reproducible）：在相同的PIVs条件下，每次运行均能获得相同的结果。

3.稳健性（Robust）：在不同但可比的PIVs条件下，获得的结果变化更小或可预测。

PBS Biotech通过使用微缩版的垂直轮（VW）生物反应器（PBS-0.1和PBS-0.5 Mini），成功开发了一套标准化的iPSC扩增工作流程。该流程不仅具有高度的稳健性和可重复性，还能轻松扩展至PBS-15（尚未测试PBS-80和PBS-500）。这一创新为iPSC生产提供了可靠的工具，有效降低了开发成本，提升了生产效率。

图1b. PBS垂直轮（VW）生物反应器家族为细胞和基因治疗提供了温和均匀的水动力学环境，以及从早研、临床和商业化规模的一系列产品。

二、iPSC生长性能指标和可重复性研究缺乏标准化，致使方法难以比较

在iPSC制造领域，缺乏详细的实验方案和标准化的结果报告，导致不同实验室之间难以对比各种iPSC培养方法。特别是在3D悬浮培养方面，尽管已有多项研究报告了细胞生长性能指标（如倍增时间、特定生长率、细胞倍增次数和最大细胞密度），但这些指标的数值差异较大，缺乏一致性。此外，干细胞制造相关文献中，关于实验方法和结果可重复性的讨论也很有限，进一步加剧了不同研究之间的对比难度。

三、建立稳健且可重复的基准iPSC扩增工作流程

通过系统化地研究关键工艺输入变量（PIVs）的范围，PBS开发了一套基线iPSC扩增协议（baseline protocol，即标准化的基本操作流程），该协议旨在确保实验的可复制性和稳健性，并展示了良好的结果一致性和可靠性。该基线协议已经在两个iPS细胞系（TC-1133，Lonza；PLX 1.0，PluriStyx）上经过24次验证，涵盖了4名操作员和4种不同的细胞培养基（mTeSR1，STEMCELL Technologies；StemScale，Gibco；StemFlex，Gibco；HBM1，内部配方），并适用于聚集体和微载体培养。详细的细胞培养协议（包括喂养、收获、计数和传代）可参考Borys, B. S. 2021[2]，而生长性能指标方程则可在Borys, B. S. 2020[3]中找到。

图2：

(A) 基线扩增工作流程在种子培养阶段实现的平均细胞倍增数的箱线图及须状图。

(B) 从2D种子培养阶段开始的累积群体倍增数，显示出高度的可复制性。

(C, D) 基线扩增工作流程中，每个2D培养阶段结束时的代表性iPSC克隆形态。

(E) P+3悬浮培养第7天的代表性iPSC聚集体形态。

(F) P+3悬浮培养第8天，iPSC在微载体上的代表性形态；细胞免疫染色结果显示核（绿色）与肌动蛋白（红色）。

结果显示在PBS 0.1L和PBS 0.5L中，分别以60RPM和40RPM的优化转速下，以2e4个细胞/ml细胞密度进行接种，培养约6-7天，细胞能平均扩增99.3±14.1倍，最终细胞收获密度为1.95±0.34e6个细胞/ml。重复实验组n=46。

四、PBS-0.1 Mini上工作流程的稳健性和可重复性验证

图3：来自P+3 iPSC聚集体悬浮培养的细胞生长曲线，采用PBS-0.1 Mini生物反应器中的补料-批批量D3-D6 50% MX喂养方案，展示了在以下不同条件下的可复制性和稳健性：

(A) 3种不同的细胞培养基；

(B) 4名不同的操作员；

(C) 2种不同的iPS细胞系。

细胞生长曲线的图例命名规则为：实验ID（年份，编号）_ 操作员 _ 容器 _ 培养基 _ 细胞系 _ 培养基更换方法 _ 搅拌速率。

五、针对下游应用优化关键PIVs

拟胚体（EB）的大小和密度（每毫升EB数）是iPSC聚集体分化为自然杀伤（NK）免疫细胞的关键工艺输入变量（PIVs）。虽然目前尚未确定从iPSC EBs生成NK细胞的最佳EB大小和密度，但这些PIVs可以通过调整生物反应器的搅拌速率（流体动力学和剪切力）以及培养基更换策略来有效控制和表征。

图4：

(A) 使用PBS-0.1 Mini生物反应器进行了搅拌速率范围的研究，旨在探讨搅拌速率对EB大小和密度的影响。实验结果表明，稳健的基线扩增协议使得在较宽的搅拌速率范围内，细胞生长能够保持一致。

(B) 通过改变搅拌速率，能够有效地控制EB的大小和密度。未来的小规模分化实验将进一步表征产生最有效NK细胞的较好EB大小和密度。一旦这些较好的条件被表征出来，就可以通过保持容器中的平均能量耗散率（EDR）恒定，结合放大相关方程式（Borys, B. S. 2021[2]），将工艺放大至生产规模体积。

六、将基线工作流程从PBS 0.1扩展到PBS-15规模

图5：

(A, B, C, D) 通过使用相同的关键工艺输入变量（PIVs），将工作体积从PBS-0.1的100mL扩展至PBS-15的10L，实现了一致的iPSC生长性能。实验中涵盖了不同的喂养策略，包括批培养、灌注和脉冲式添加，所有这些方法都确保了细胞生长曲线的一致性和可重复性。

结论、iPSC及其衍生特化细胞的制造规模生产

1.iPSC及其衍生特化细胞的规模化生产需要经过多轮、系统化的工艺开发，确保协议的稳健性和可复制性。微缩模型在这一过程中起到了至关重要的作用，作为一种成本效益较高的工具，能够有效支持工艺优化。

2.通过使用PBS-0.1和PBS-0.5 VW生物反应器，PBS已经开发出一套基线的iPSC扩增工作流程，该流程作为后续工艺优化的起点。该基线工作流程的开发，考虑了细胞系、材料和时间线等限制因素，同时为下游应用提供了灵活的优化空间。值得一提的是，这一基线扩增工作流程已成功放大至PBS-15，表现出良好的扩展性和稳定性。

3.未来的工作将面临一系列放大挑战，特别是在控制培养基中的溶解氧、pH值、关键操作的处理时间以及封闭系统处理方面。这些挑战需要解决，以确保能够实现效率高、可靠的制造规模工艺。

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